Il differenza principale tra fase inversa e cromatografia di interazione idrofobica è che il la cromatografia in fase inversa (RPC) utilizza un mezzo più idrofobo, che porta a interazioni più forti mentre la cromatografia a interazione idrofobica (HIC) utilizza un mezzo meno idrofobo rispetto al mezzo nella cromatografia in fase inversa.

La cromatografia in fase inversa e la cromatografia di interazione idrofobica sono due tecniche cromatografiche che dipendono dalle interazioni tra le superfici idrofobe di un mezzo cromatografico e le macchie idrofobe sulla superficie delle biomolecole.

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Cos'è la cromatografia in fase inversa

La cromatografia in fase inversa (RPC) è una tecnica cromatografica utilizzata nella purificazione e nell'analisi di biomolecole come proteine, peptidi e oligonucleotidi. Fornisce una separazione ad alta risoluzione ed è ideale per la mappatura dei peptidi e il controllo della purezza. L'RPC è più spesso utilizzato nella lucidatura finale di peptidi e oligonucleotidi.

Come fase stazionaria possono essere utilizzati due tipi principali di mezzi idrofobici: perle di silice ricoperte di catene di carbonio o polimeri idrofobici nudi. Una colonna viene riempita con il mezzo idrofobo sotto forma di letto impaccato su cui viene applicato il campione. Un agente di accoppiamento ionico come l'acido trifluoroacetico (TFA) può essere aggiunto alla fase mobile per migliorare la formazione di interazioni idrofobiche. All'inizio viene utilizzato un modificatore organico come il 5% di acetonitrile e l'eluizione può essere avviata con l'aumento della % di acetonitrile.

Figura 1: Teoria della cromatografia in fase inversa

Le biomolecole che sono meno idrofobe/più polari verranno eluite per prime, mentre le molecole più idrofobe verranno eluite in seguito. RPC è la tecnica cromatografica con la più alta risoluzione.

Cos'è la cromatografia ad interazione idrofobica?

La cromatografia di interazione idrofobica (HIC) è l'altra tecnica utilizzata nella separazione di biomolecole basata sull'idrofobicità in condizioni moderate. È una tecnica ideale per la purificazione delle proteine ​​quando i campioni devono essere sottoposti a precipitazione di solfato di ammonio nella concentrazione iniziale del campione e nella pulizia. L'elevato livello di sale durante la precipitazione del solfato di ammonio aumenta l'interazione tra i componenti idrofobici.

Figura 2: Effetto dell'elevata concentrazione di sale sulle interazioni idrofobiche

Il mezzo idrofobo di HIC è costituito da una matrice inerte di particelle sferiche ricoperte con ligandi contenenti gruppi alchilici o arilici. Le interazioni idrofobiche si verificano in presenza di concentrazioni di sale moderatamente elevate (tipicamente 1–2 M di solfato di ammonio o 3 M di NaCl). Il tampone di avvio assicura il legame delle proteine ​​di interesse al mezzo lavando via le impurità. Il tampone di eluizione contiene una bassa concentrazione di sale, indebolendo l'interazione tra le proteine ​​e la fase stazionaria.

Somiglianze tra cromatografia in fase inversa e cromatografia ad interazione idrofobica

Differenza tra cromatografia in fase inversa e cromatografia ad interazione idrofobica

Definizione

La cromatografia in fase inversa (RPC) si riferisce alla tecnica di separazione a più alta risoluzione basata sull'idrofobicità delle molecole in una miscela mentre la cromatografia ad interazione idrofobica (HIC) si riferisce a un tipo di tecnica di separazione basata sull'idrofobicità ma opera in condizioni relativamente miti.

idrofobicità

L'RPC opera in condizioni più idrofobiche mentre l'HIC opera in condizioni idrofobiche relativamente miti.

Interazioni

La cromatografia in fase inversa porta a interazioni più forti tra le molecole e la fase stazionaria che deve essere invertita durante l'eluizione da un modificatore organico mentre l'HIC porta a interazioni moderatamente elevate tra la fase stazionaria e le molecole.

Mezzi idrofobici

RPC utilizza perle di silice ricoperte da catene di carbonio o polimeri idrofobici nudi mentre HIC utilizza una matrice inerte di particelle sferiche rivestite con ligandi contenenti gruppi alchilici o arilici.

Buffer di avvio

Il tampone iniziale in RPC utilizza acido trifluoroacetico (TFA) mentre il tampone iniziale di HIC utilizza concentrazioni di sale moderatamente elevate.

eluizione

L'aumento della percentuale di acetonitrile inizia l'eluizione in RPC mentre la diminuzione della concentrazione di sale inizia l'eluizione in HIC.

Risoluzione

La cromatografia in fase inversa è la tecnica cromatografica con la più alta risoluzione mentre la risoluzione dell'HIC è bassa rispetto all'RPC.

Applicazioni

L'RPC viene utilizzato nella separazione di proteine, peptidi e oligonucleotidi mentre l'HIC viene utilizzato principalmente nella purificazione delle proteine.

Conclusione

La cromatografia in fase inversa è la tecnica cromatografica con la più alta risoluzione, che opera in condizioni altamente idrofobiche. Ma HIC opera in condizioni idrofobiche moderate. RPC e HIC sono i due tipi di tecniche di separazione basate sull'idrofobicità. La principale differenza tra RPC e HIC è il grado di idrofobicità utilizzato in ciascuna tecnica.

Riferimento:

1. Interazione idrofobica e cromatografia in fase inversa: principi e metodi. GE Healthcare, 2006. Disponibile qui

Cortesia dell'immagine:

1. "Schema di eluizione del gradiente di fase inversa" di Nategm - Opera propria (CC BY-SA 4.0) tramite Commons Wikimedia 2. "Hicsalt" di Daliak su Wikibooks inglese - Trasferito da en.wikibooks a Commons. (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia